Polo di medicina molecolare per il gruppo policlinico

Avrà sede al centro di neuro-bio-oncologia di Vercelli

In un futuro molto prossimo la Medicina molecolare, applicata all’oncologia e ad altre discipline, approderà al Policlinico di Monza e si svilupperà in tre principali filoni: l’oncologia molecolare, la genetica medica e la biobanca dei tessuti.

A illustrare il tutto è stato il Prof. Emilio Bajetta, Direttore clinico e scientifico dell’IDO (Istituto di Oncologia del Policlinico di Monza), che è riuscito come sempre a rendere comprensibili argomenti ostici come questo. “Una volta le terapie oncologiche erano uguali per tutti i pazienti – spiega il Prof. Bajetta – bastava un semplice esame istologico su cui poi si fondava il programma di cura. Oggi invece abbiamo a disposizione i cosiddetti biofarmaci o farmaci intelligenti, questo perché gli studi degli ultimi anni hanno evidenziato che ogni paziente possiede degli oncogeni che si differenziano per caratteristiche e peculiarità da quelli di altri pazienti. Nel momento in cui si è cercato di far incrociare il farmaco intelligente con le caratteristiche peculiari del paziente affetto da patologia tumorale, ne è nata l’oncologia molecolare”.
Al momento solo alcuni cromosomi sono stati analizzati completamente, rivelando migliaia di sequenze geniche, gran parte delle quali appartenenti a geni funzionali fino ad ora sconosciuti.

Sembra probabile che nel prossimo decennio saranno identificati la maggior parte dei geni coinvolti nella trasformazione neoplastica.
Grazie a questi studi, si può oramai stimare che vi siano approssimativamente 3000 geni che codificano per proteine (recettori, proteine di canali ionici, chinasi ed altri enzimi) che potrebbero essere possibili bersagli di terapie mirate, soprattutto in ambito oncologico. Alcuni di questi bersagli sono ben noti; per molti di essi, invece, deve ancora essere valutato l’effettivo coinvolgimento con determinate neoplasie o, comunque, deve essere dimostrato l’effettivo valore come bersaglio terapeutico. Un ulteriore passo in avanti nella comprensione dei meccanismi molecolari del cancro è stato indubbiamente il sequenziamento del genoma umano, di cui si è avuta una prima “bozza” già nel 2001. Il sequenziamento completo è ovviamente solo il primo risultato nello studio della sequenza genomica umana e sono richieste ancora molte e approfondite indagini, per avere un quadro completo e chiaro dei complessi meccanismi che regolano la crescita cellulare.
In molti tipi di tumore la diagnosi istologica ed immuno-istologica non è più il punto di arrivo, ma è il punto di partenza per ulteriori indagini che portano alla cosiddetta diagnostica molecolare propedeutica alla selezione dei pazienti da avviare alle terapie biologiche, ossia alle cosiddette terapie personalizzate. “Nell’ambito della genetica medica – continua Bajetta – ciò che interessa è quella parte che chiamiamo medicina predittiva ovvero lo studio del patrimonio genetico del paziente, dove la conoscenza dei propri oncogeni permette di capire se il paziente è a rischio di sviluppare certi tipi di tumori. Ad oggi gli studi più avanzati riguardano la patologia oncologica della mammella e dell’intestino”.

L’esame per capire la propria predisposizione genetica a sviluppare nel tempo un tumore al seno, per esempio, è relativamente poco costoso, si parla di circa un migliaio di euro e generalmente viene richiesto da quelle donne che hanno avuto in famiglia più di un caso di tumore alla mammella in parenti stretti come la madre, la nonna o la sorella.

“Occorre a mio avviso – prosegue il Prof. Bajetta – fare alcune riflessioni su questo argomento. L’esame, per quanto all’avanguardia, fornirà una percentuale di rischio e mai una certezza e poi bisogna distinguere la donna che in età matura decide consapevolmente di sottoporsi all’esame, dalla ragazzina di 14/16 anni che, come accade oggi in alcuni paesi europei, viene sottoposta a mastectomia bilaterale preventiva per scongiurare il pericolo di una possibile patologia tumorale che, forse, svilupperà solamente tra venti anni, se non più tardi, quando magari la medicina avrà compiuto ulteriori passi avanti per curare definitivamente e con successo la patologia cancerosa della mammella”.
L’ultimo filone della Medicina molecolare riguarda la Biobanca dei tessuti. L’avanzamento della ricerca per l’identificazione di geni responsabili dello sviluppo di specifiche malattie e delle possibili applicazioni in ambito terapeutico, richiede la possibilità di disporre di campioni biologici di persone affette o portatrici o predisposte a patologie su base genetica. Le collezioni di materiali biologici, campioni di tessuti e linee cellulari, sono definite biobanche genetiche e rappresentano un’importante fonte di risorse per la ricerca medica, sia in ambito diagnostico che terapeutico.

Lo “Swedish Medical Research Council”, in un documento del 1999, definisce le biobanche come raccolte di campioni di tessuti umani, la cui origine sia sempre rintracciabile, conservati per un periodo definito o indefinito per specifici progetti di studio. Pertanto le biobanche possono essere definite come “unità di servizio, senza scopo di lucro diretto, finalizzate alla raccolta e alla conservazione di materiale biologico umano utilizzato per la diagnosi genetica, per studi sulla biodiversità e per la ricerca”.

In considerazione del tipo di campioni conservati, le biobanche possono essere raggruppate in due grandi categorie, ovvero le biobanche genetiche e le biobanche tessutali.
Le biobanche genetiche conservano i seguenti tipi di campioni biologici umani:

• Campioni di tessuti umani
• Linee cellulari umane
• Campioni di DNA
• Materiale transgenico/ingegnerizzato

Le biobanche genetiche si caratterizzano per la raccolta e la conservazione di campioni provenienti da:

• Persone e famiglie con patologie genetiche
• Gruppi di popolazione con alta frequenza di portatori o di affetti da patologie genetiche
• Popolazioni con caratteristiche genetiche idonee per l’individuazione di geni di suscettibilità (es. popolazioni con ridotta variabilità inter-individuale, forte endogamia)
• Gruppi di popolazioni idonee per studi di farmacogenetica
• Gruppi di popolazione utilizzati come controllo

La maggiore utilità delle banche dei tessuti/organi è quella di svolgere ricerche nell’ambito delle patologie tumorali. I risultati sono condizionati sia dalla qualità e accessibilità dei campioni sia dalla affidabilità e portata delle informazioni conservate insieme ai tessuti. L’istituzione di una biobanca deve garantire:

• La privacy del soggetto donatore
• La qualità del campione e la conservazione del campione per il maggior tempo possibile
• Il corretto utilizzo e la distribuzione del campione “Sono certo che la nascita di questo centro di Medicina molecolare del Policlinico di Monza, non potrà che essere un valore aggiunto per la Struttura.

La sede sarà quella di Vercelli dove è già presente e attivo il Centro di ricerca di Neuro-Bio-Oncologia diretto dal Prof. Davide Schiffer”. Specializzato nello studio genetico dei tumori cerebrali, il Prof. Davide Schiffer spiega: “Lo studio e la diagnostica dei tumori cerebrali, iniziati nel XIX secolo, hanno trovato una prima sistemazione moderna nella classificazione di Bailey e Cushing (1927-32), cosiddetta istogenetica. Ciò significava che la diagnosi era basata sulla rassomiglianza che le cellule tumorali avevano con quelle della citogenesi nervosa (il passaggio cioè da stadi di immaturità a stadi di maturità: dall’embrione all’adulto).

La prognosi invece si basava sulla maggiore o minore immaturità delle stesse: immaturità conseguente malignità e maturità conseguente benignità. Lo sviluppo dell’immunoistochimica e della biologia molecolare ha ultimamente condotto queste discipline ad inserirsi progressivamente nella diagnosi e prognosi dei tumori cerebrali al punto che oggi la sola morfologia non è più in grado di sostenerle appieno, anche se rimane come base principale”.

La patologia rimane infatti ancora fondamentale per la diagnosi e la prognosi dei tumori cerebrali, ma l’immunoistochimica e la genetica molecolare hanno così grandemente contribuito all’identificazione dei meccanismi e delle vie molecolari della trasformazione che non possono non essere considerate anche nella diagnosi e prognosi. Il loro scopo principale è stato comunque l’approfondimento dell’eziopatogenesi dei tumori, gliomi in particolare, consentendo di aprire nuove vie di accesso alla loro terapia: si pensi soltanto allo sfruttamento della staminalità nell’aggressione ai tumori e all’uso di anticorpi o silenziatori o microRNA contro steps delle innumerevoli vie molecolari trovate per arrestare la crescita dei tumori. È nata così la questione dei biomarker oggi molto usati. Per i gliomi vi sono numerosi biomarker, distinti in diagnostici, prognostici e predittivi, che vengono rilevati su campioni chirurgici e su fluidi corporei del paziente. In realtà, la questione della loro utilità e utilizzo è ancora controversa e per la loro valutazione è stato creato un sistema basato sulla performance analitica e clinica (prognosi, predizione) e sull’utilità clinica con punteggio da A a D (Tabella I). Il punteggio assegnato a sei biomarker (mutazioni di IDH1/2, co-delezione di 1p/19q, indice di proliferazione Ki67, metilazione di MGMT, amplificazione di MYCN e mutazioni di β-catenina) è riassunto in Tabella II. I test che si eseguono presso il Centro di Neuro-Bio-Oncologia sono numerosi e dieci sono quelli che accompagnano ogni consulenza diagnostica che ci viene richiesta.

1. Mutazioni somatiche puntiformi dei geni IDH1/2. Sequenziamento diretto (Sanger) ed immunoistochimica per la proteina mutata (p.R132H). Diagnostico e prognostico.
2. Ipermetilazione del promotore del gene MGMT (06-metilguanina DNA metiltransferasi). PCR – metilazione specifica (MS-PCR) e analisi di frammenti. Discussa l’attendibilità del metodo immunoistochimico. Prognostico e predittivo.
3. Co-delezione dei loci 1p/19q. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Diagnostico, prognostico e predittivo.
4. Amplificazione genica di EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). PCR e analisi di frammenti. Immunoistochimica. Diagnostico e prognostico
5. Analisi mutazionale del gene TP53 (Tumor Protein p53). Sequenziamento diretto (Sanger). Immunoistochimica. Diagnostico e prognostico.
6. Analisi mutazionale del gene PTEN (Phosphatase and Tensyn Homologue) Sequenziamento diretto (Sanger). Immunoistochimica. Relativamente prognostico.
7. Analisi mutazionale del gene BRAF (VRaf Murine Sarcoma Viral Oncogene Homolog B1). Sequenziamento diretto (Sanger). Ricerca della duplicazione in tandem dei geni BRAF-KIAA1549 e dei geni SRGAP3-RAF1. RT-PCR. Diagnostico.
8. Ipermetilazione del promotore del gene EMP3 (Epithelial Membrane Protein 3). PCR – metilazione specifica (MS–PCR) e analisi di frammenti. Immunoistochimica. Diagnostico e prognostico
9. Analisi dello stato genico dei geni p14, p15, p16 MLPA. Prognostico.
10. Ricerca della traslocazione ei geni EWSETS. RC-PCR. Diagnostico.
11. Ki67/MIB. Immunoistochimica con anticorpo monoclonale. Prognostico.

Il numero di biomarker studiati presso il Centro è molto più alto, ma non vengono ancora usati direttamente nella definizione diagnostica e nella prognosi delle neoplasie gliali. Essi sono: GFAP, Nestina, Vimentina, CD131, CD134, CD68, mTOR, S6, STAT3, Survivina, SOX2, REST, SEL1LA etc.

L’uso dei biomarker per i gliomi in clinica ha un significato netto e preciso soltanto per le mutazioni di IDH1/2, seguito dalla co-delezione di 1p/19q e metilazione di MGMT. Bisogna dire che la loro validità è massima quando sono contemporaneamente diagnostici e prognostici. A questo proposito bisognaanche distinguere quando la loro validità è valutata dopo confronto di categorie tumorali diverse o quando è valutata all’interno di una varietà. Per esempio, PTEN oppure anche Ki67 sono prognostici quando sono diagnostici, come nel confronto fra l’astrocitoma ed il glioblastoma, ma non all’interno della categoria del glioblastoma. Molto spesso però i biomarker sono usati nella valutazione statistica delle sopravvivenze o dei PDF (Period Disease Free) dopo radioterapia o chemioterapia e servono per rilevare gli effetti delle terapie quando queste non sono radicalmente efficaci.
Dall’elenco dei biomarker non sono stati inclusi, perché escono dalla definizione data all’inizio, tutti gli indicatori delle vie molecolari conosciute che segnalano all’interno di una neoplasia. Queste potranno avere una grande importanza nelle genesi dei gliomi, e nella loro prevenzione, quando gli studi sull’origine dei tumori lo permetteranno. Similmente la loro importanza si rivela quando si è alla ricerca di un anticorpo o inibitore o siRNA o microRNA che serva a bloccare quel determinato passo molecolare, in genere sulle vie che conducono alla proliferazione del tumore. Per esempio, il farmaco Bevacizumab è un anticorpo che inibisce VEGF che stimola l’angiogenesi; in questo caso VEGF diventa un biomarker. La stessa cosa può dirsi degli inibitori di mTOR sulla via di AKT/PI3.
Si è detto all’inizio che le cellule staminali tumorali possono entrare nel discorso dei biomarker, perché se risulterà che sono queste a sostenere la crescita, la recidiva e la resistenza alle terapie del glioblastoma, gli antigeni da loro espressi o loro peculiarità molecolari, in un qualche modo evidenziati in vivo, diventerebbero dei biomarker.
Infine va sottolineato che tutti biomarkers per i gliomi – ma questo crediamo valga anche per molti tumori sistemici -, non possono essere eseguiti o usati senza conoscere a fondo il contesto biologico in cui si inseriscono. I metodi per il loro rilevamento non possono essere applicati come le ricette da un cookbook delle casalinghe. È un atto critico quello che li riconosce come tali fra una miriade di altri dati geno- e fenotipici che caratterizzano i gliomi. È sufficiente leggere qualche lavoro per capire ed identificare un qualcosa che poi sarà biomarker. Le figure 1 e 2 illustrano un esempio di come si producono i biomarker.